POCKIT™技術平台

一般而言PCR在反應過程需要三種不同的溫度，分別是利用高溫解離DNA雙股結構(92 – 95℃, denaturing)， 利用降低溫度使專一性引子黏合於特定序列(37 – 65℃, annealing)， 以及再升溫至最適於熱穩定性DNA聚合酶活性的溫度(72℃)進行延長反應(extension)。 因此相關的操作設備必須能夠快速的升溫與降溫，同時具備有高階的溫控系統。這使得設備變得相當複雜， 重複的升降溫也造成設備容易損壞，和反應時間的增加。

POCKIT™則是利用熱對流的原理，此一物理現象即是描述當針對裝有液體的容器底部加熱時， 由於上方表面較冷的液體比重較高，因此會因為重力向下移動；下方受熱的液體則因為比重較低，因此會被擠到向上移動， 因此會自然形成液體的迴圈。當較熱的液體流動至表面時，又會因為環境的散熱而變冷， 較冷的液體流動至底部時又會因為受熱而變熱，所以此一迴圈可以一直持續下去，進而形成穩定的溫度梯度。 此時如果藉由容器的設計，利用最適的管徑與高度，巧妙的控制對流的時間與散熱的速率， 就可以形成適合PCR的反應環境。當我們在特殊設計的容器中放入PCR反應的試劑， 並且控制底部的加熱溫度在92 -95℃之間，當試劑流至底部時，就可以進行解離DNA雙股結構的反應(denaturing)， 當液體循環至容器頂端並且降溫時，就可以進行引子黏合(annealing)， 之後再迴圈至較熱區域進行延長反應(extension)。換言之，當熱對流不間斷的過程之中，PCR的反應也隨之完成。

因此，POCKIT™的優勢就變的顯而易見。首先，因為只需單純的底部單一溫度控制， 因此不需複雜的控溫系統與降溫系統，可以大幅的輕量化，並且更加耐用。 第二，自然的溫度梯度取代機械式的升降溫，使得反應更加穩定，避免機械故障， 同時省去升降溫所需的時間。POCKIT™系統將熱對流的速率控制在每一圈15 – 20秒左右， 遠比傳統的PCR有效率，因此可以大幅縮減反應所需要的時間。

POCKIT™的試劑與傳統的PCR非常相似，包含有引子、dNTP、反應緩衝液、熱穩定性DNA聚合酶、與核酸範本(template)等。因為POCKIT™是利用螢光信號偵測PCR反應產物，因此尚需如real-time PCR一般加入螢光探針(probe)，這同時也提高了反應的專一性。

為了穩定熱對流的流速，降低液體與管壁間的作用力， 促進溫度梯度的形成，以及提升DNA聚合酶的效率，POCKIT™的反應緩衝液 – Uni-ii buffer中添加有若干的特定化學物。 為了適用於更為寬廣的引子條件，我們提供了高鹽與低鹽兩種反應緩衝液， 以供使用者選擇。這也是POCKIT™試劑與一般PCR最大的不同之處。

是的。因為以下的原因：
￭ 光學塑膠材質：螢光透光性強
￭ 醫療塑膠等級：無DNase/RNase污染
￭ 專利底部金屬環設計：加熱均勻
￭ 完美管徑與管高比例：提供熱隔絕恒溫PCR的最佳環境
￭ 內徑平整：穩定熱對流迴圈
￭ 緊配內蓋：避免試劑揮發污染

￭ IQ plus系列：為針對水產養殖市場所開發的試劑組。
￭ POCKIT系列：為針對家畜禽養殖市場所開發的試劑組。 
詳細的內容請參考公司網站。

可以，但是因為以下的原因並不建議
￭ 反應條件未於傳統PCR或是real-time PCR上最優化
￭ 引子與酵素的濃度高於傳統PCR或是real-time PCR所需，較易產生非專一性反應
￭ 不含被動性螢光染劑(passive dye, 如ROX)
￭ 緩衝液系統與傳統PCR或是real-time PCR不同

可以，POCKIT™內建程式中最開始就是執行50℃10分鐘的反轉錄反應。 不論是DNA或是RNA的樣本，系統都會執行此一步驟。POCKIT系統所提供的Uni-ii緩衝液同時適用於反轉錄反應以及PCR反應， 使用者只需確認於反應中有添加反轉錄酵素(MMLV or AMV reverse transcriptase)即可。 添加量與傳統的PCR相同。

POCKIT™是針對核酸，也就是DNA以及RNA進行檢測， 因此對於感染性疾病的病源，如病毒、細菌、寄生蟲等的核酸， 或是某些因為特定DNA變異造成的遺傳性疾病，都可以有效檢測。但是對於一些代謝的指標，如肝指數、血糖等， 或是不具核酸的病源如狂牛症，以及像是毒品與禁藥、 農業等化學物質，則無法進行檢測。

POCKIT™ 是全新的技術，但是基於以下的原因，它也是非常穩定的技術 

￭ POCKIT™的基本原理是PCR，是分子生物領域最廣為應用，最穩定的技術。
￭ POCKIT™的加熱原理與反應採用自然界的現象 - 熱對流，比機械式的控制更為簡單、有效。
￭ POCKIT™的研發、生產、與銷售流程皆符合醫療器材品質管制系統ISO13485以及體外檢測(in-vitro diagnosis, IVD) GMP的生產規範。
￭ 運用POCKIT™技術於不同領域的學術研究已經陸續發表在全球知名期刊之上，證明這是一種有效 且可以廣泛運用的技術。

POCKIT™在設計之初就是鎖定為現場攜帶式的核酸檢測設備，因此當有這種需求時， 可以選擇投資行動實驗室－POCKIT™ Xpress 或POCKIT™ combo。兩套設備皆包含了POCKIT™核酸分析儀、 cubee™小型高速離心機，以及高精度移液器 ; POCKIT™ combo更配備了taco™ mini 核酸自動萃取儀， 上述設備都包裝於儀器專用防水硬殼行李箱之中。行李箱內還具有專門的空間可以放置塑膠類的耗材， 與反應所需的試劑，足以滿足現場採集樣本、核酸萃取與PCR結果分析的所有需求。

POCKIT™在操作環境上仍然是有基本的限制存在，包括： ￭ 必須有穩定的交流電源供應，100 – 240V，50/60Hz。 ￭ 擺放儀器的平面必須相對平整。 ￭ 環境溫度的範圍為15 - 35℃。 ￭ 以上二、三點皆與熱對流的穩定性有關。

可以，POCKIT™的光學系統可以利用窄波長濾鏡(band pass filter)， 收取520nm及550nm兩種不同的散射光源信號，因此只要將不同標的的螢光探針分別標定合適的螢光物， 如FAM (520nm)以及JOE (550nm)，即可於單一反應之中同時檢測兩種標的。 POCKIT™系統的PCR反應是利用熱對流所產生的溫度梯度所驅動，與傳統的PCR不同， 因此在設計雙重標的(duplex system)的實驗時，必須要特別注意引子、探針之間產生雙重子(dimer)，以及引子、 探針本身產生二級結構的可能，以避免反應之間互相干擾。 雙重標的系統之間多少都會彼此競爭反應資源，此一部份的設計理念與傳統的雙重標的PCR系統相同。

因為螢光物質的特性，520nm的散射光信號可能會影響到550nm，因此一般建議請將主要的檢測標的設計於520nm，並將次要的標的如內控制組(intenal control)設計於550nm。

使用者唯一可以設定的反應條件是波長的選擇，分別是520nm單波長、550nm單波長、以及520 + 550nm雙波長三種選擇。 在反轉錄以及隔絕式恆溫PCR部分，經過多年的研究與測試，最廣泛且優化的反應條件組合已經被找到， 並且已經成功的運用在POCKIT™系統之上。為了輕量化、使用介面簡單化和人性化和可攜性設計，POCKIT™將所有非必要的功能都儘量捨棄，因此使用者無法自行設定相關的反應條件。 然而，單一反應條件、人性化使用介面與極簡的設計理念，正是POCKIT™與眾不同之處。

POCKIT™內建Android智慧型手機晶片系統，會於反應前後搜集、運算、監控內部光學系統的運作， 並於反應結束後直接將螢光信號的變化比轉化為結果，並且顯示於觸控螢幕上。因此使用者無需自行判讀結果， 所有的工作POCKIT™都會代為執行。同時反應前後光學系統的定位照片、螢光原始讀值、螢光比、與判讀結果， 都會存檔於SD卡中以開機時間為目錄名的目錄之下，供使用者隨時查詢、記錄、確認之用。

POCKIT™的光學系統設計與試劑設計原理都與real-time PCR非常相似，有潛力可以發展成定量的系統， 但是為了考慮具有定量需求的現場檢測項目有限，同時為了貫徹輕量化、使用介面簡單化和人性化及可攜性設計， POCKIT™捨棄了定量功能，而只具備了判讀正負的定性能力。 當科技持續進步， 使得晶片運算與控制能力進一步提升時， 下一代的POCKIT™將會很有機會可以像real-time PCR一樣，具有核酸定量能力，同時保有可攜式的特性。

沒有，但我們提供POCKIT™系統螢光探針的設計諮詢服務，以及改善方向的建議。

可以，但是並不建議。為了穩定熱對流的流速，降低液體與管壁間的作用力，促進溫度梯度的形成， 以及提升DNA聚合酶的效率，POCKIT™的反應緩衝液 – Uni-ii buffer中添加有若干的特定化學物， 而這些物質是市售PCR緩衝液中所沒有的。因此，仍然建議使用POCKIT™的專屬緩衝液。 POCKIT™專用的Uni-ii buffer中已含有最佳濃度的dNTP，因此使用者不需另行添加。

至於酵素部份，因為市售的品牌與種類繁多，使用者必須自行測試與比較，如果不想浪費時間在測試酵素上， 也可以直接選購POCKIT™專用的酵素。酵素的使用量會依不同的反應系統而不同， 於條件優化之前，可先依傳統PCR及RT-PCR的建議使用量添加，之後再依優化的結果酌予增減。

與real-time PCR類似，並應依照下列的基本規則設計：
￭ 產物大小應小於150鹽基對(bps)，一般而言愈小愈好。
￭ Tm應在58 – 62℃之間。
￭ 避免4個以上的連續相同鹽基。
￭ 3'末端的5個鹽基避免含3含以上的G與C。
￭ G與C的比例應該占全部的20 – 80%之間。
￭ 總長度應在15 – 25個鹽基之間

最適用於POCKIT™的螢光探針為TaqMan^® probe，其基本的設計規則如下：
￭ 5'端螢光團應使用FAM (520 nm)或 JOE、VIC (550nm)。
￭ 3'端螢光抑制染劑(quencher dye)應用black hole quencher (BHQ1)或是minor groove binder (MGB)。
￭ Tm應在68 – 72℃之間 – 高於引子10℃。
￭ 與引子間應至少有一個mer 的距離以避免立體干擾。
￭ 避免4個以上的連續相同鹽基。
￭ 以下為與一般real-time PCR不同之處
￭ G與C的比例應該占全部的40 – 80%之間。
￭ 總長度應在15 – 30個鹽基之間，短比長好。
￭ 5'端與範本間的黏合強度要強(較大的負自由能，ΔG)。
￭ 應避免設計在範本二級結構的穩定區域。

PCR反應的成敗有相當程度的依賴引子的品質，其可能的影響因數如下：
￭ 引子的設計：Tm、二級結構、雙重子(dimer)的形成可能等。
￭ 引子的合成品質：供應商的經驗、合成原物料的品質、純化的方法等。
￭ 引子的濃度

使用者基本上可以依照Q17所述的原則進行設計，並建議如下：
￭ 左右兩端的引子除了原本的設計之外，都可以試著以多一兩個鹽基或是少一兩個鹽基的方式多合成幾條， 並藉由不同的排列組合中，找到最佳的引子對。
￭ 合成時要求引子必須以PAGE純化。
￭ 測試不同的引子對比例、濃度以及使用的酵素濃度，找尋最佳條件。
￭ 在靈敏度上，可藉由陽性樣品的序列稀釋，測試不同條件的稀釋終點，以最靈敏的條件為最佳。
￭ 一般而言，POCKIT系統的靈敏度至少可達100 copies/反應。